禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

中国禽流感诊断技术和疫苗的研究进展

介绍了我国在禽流感诊断技术和疫苗研制方面的一些新技术、新成果，新特点和新思路，分析比较了目前建立的诊断方法和各类疫苗，从整体上展示了我国禽流感诊断技术和疫苗研究状况，对了解和掌握禽流感研究动态，优化禽流感监测手段，调整禽流感防疫策略等有一定的参考价值。     

禽流感病毒分子生物学的研究进展

禽流行性感冒(av ian in fluenza,A I,简称禽流感)是由A型禽流感病毒(av ian in fluenza v irus,A IV)引起的禽类烈性传染病。作为被世界动物卫生组织(O IE)定为A类的传染病,A I不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失,而且对人类健康和生命安全构成了严重威胁。因此,A I已经成为人们关注的焦点,国内外学者也对其进行了大量研究。作者从病原基因组及其编码的蛋白质、致病力、变异性以及对人类感染A IV的分子机制等角度就A IV的分子生物学研究作一综述,为防制A I提供理论基础,并在此基础上探讨了人类禽流感的防治措施,加深人们对A I的认识。     

H5N2与H5N1禽流感油乳灭活疫苗免疫鹅群对H5N1流行株攻毒的保护效力及母源抗体对免疫效力的干扰

应用H5N2和H5N12种类型禽流感油乳灭活疫苗分别免疫鹅群,观察比较了二者对H5N1型高致病性禽流感病毒的攻毒保护效力。结果表明,在同等剂量免疫条件下,从发病率、死亡率和泄殖腔排毒规律3项指标综合评价来看,H5N1灭活苗水禽免疫组对高致病性禽流感H5N1流行株攻毒的保护效率较H5N2灭活苗理想,且水禽禽流感母源抗体对灭活苗免疫具有一定的干扰作用。     

H5亚型禽流感病毒HA基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统对H5亚型禽流感病毒HA基因在sf9细胞中的表达进行了研究。首先将pUCm—T—H5HA质粒用BamHⅠ及NotⅠ酶切，获得HA基因片段，同时杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ也用BamHⅠ及NotⅠ酶切，然后用T4DNA连接酶连接，构建了重组质粒pFastBac—H5HA。再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌，在体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选，得到杆状病毒重组质粒Bacmid—H5HA。将Bacmid—H5HA转染sf9细胞，获得重组杆状病毒，经SDS—PAGE和Western blotting检测表明，HA蛋白在重组杆状病毒中获得表达。     

禽流感H9亚型病毒WD株毒种的纯化研究

采用鸡胚终点稀释法并结合ND抗血清中和法对禽流感H9亚型病毒WD株毒种进行了纯化。将纯化的WD株毒种在SPF鸡胚连续传12代，对各代次毒种进行了毒价测定，选择一定代次的毒种进行了免疫原性试验及外源病毒检验。结果表明，WD株在鸡胚中连续传12代，其HA价稳定在1：512—1：1024，毒价在10^7.0-10^8.3 EID50／0．1mL；不同代次毒种不含外源病毒，免疫原性均符合要求。由此可见，毒种的纯化方法是有效的，将WD株毒种限制在12代内是可行的，并建立了该毒种的种子批。     

禽流感病毒H5亚型主要保护性抗原在禽痘病毒中的高效表达

将H5亚型禽流感病毒血凝素HA基因克隆入插入载体pllS中获得重组转移质粒p11SH5A,通过酶切鉴定获得了预期的转移质粒p11SHSA,将质粒p11SHSA和野生禽痘病毒(wtFPV)共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒rFPV-11SH5A.以间接免疫荧光法证实,HA基因得到了表达.将该重组病毒rFPV-11SH5A以10(5)PFU/只免疫7日龄SPF鸡,于7、10、14、18、21d分别采血分离血清检测HI抗体,于免疫21d后用10(5)ELD50的野生病毒进行肌肉注射观察疫苗保护率.结果表明,该疫苗能提供100%的保护.     

表达猪流感病毒血凝素基因的重组腺病毒的构建及免疫原性分析

通过细菌内同源重组的方法成功构建了表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素的重组腺病毒。首先将血凝素基因亚克隆到穿梭载体质粒pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP上，与腺病毒基因组质粒pAdeno Vator△E1／E3共转化大肠杆菌BJ5183菌株，经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd—HA—GFP。将该重组质粒转染293细胞以包装重组腺病毒。根据报告基因GFP的表达及Western-blot分析，证明获得了可正确表达猪流感病毒血凝素的重组腺病毒rAd—HA—GFP。重组腺病毒经一次性腹腔注射接种昆明鼠，2周后可检测到血凝抑制抗体，并且抗体至少可以持续12周，证实重组腺病毒介导表达的血凝素蛋白具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单克隆抗体的研制及鉴定

以抗H5亚型禽流感病毒（AIV）JSD株鸡胚尿囊液免疫8周龄BALB/c小鼠,第4次免疫后取其脾淋巴细胞与SP2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验（HI）对杂交瘤进行筛选,经3次亚克隆后,共获得4株针对血凝素（HA）蛋白的特异性单克隆抗体,分别命名为：2D2、2C8、3D3和3D11。该4株单抗的小鼠腹水的HI效价在2^13～2^15,ELISA效价为1.2×10^5～5.1×10^5。亚类鉴定结果表明,2D2和3D11属于IgG1,2C8属于IgG3,3D3属于IgG2a亚类;特异性试验结果表明,上述4株单抗仅与H5 AIV毒株发生特异性反应,而不与其他亚型AIV以及NDV、IBV和EDSV-76等病毒反应;鸡胚中和试验结果显示,4株单抗均具有较好的中和活性。本研究成功获得4株针对H5 AIVHA蛋白的特异性单抗,为临床H5 AIV的血清学监测及鉴定提供了必需的试剂。     

猪流感抗体间接ELISA检测方法的建立

猪流感病毒A／Swine／Fujian／668／2001（H3N2）株感染的鸡胚尿囊液，经差速离心后，再经蔗糖密度梯度离心，提纯、纯化的猪流感病毒经NP-40处理并反复冻融，作为猪流感间接ELISA抗原，确立了间接ELISA检测方法。对29份HI试验猪流感为阴性的血清进行了检测，经统计学分析，确定间接ELISA判定标准，被检血清OD490nm值≥0．20判定为阳性。该方法对猪瘟等11种猪疫病阳性血清无交叉反应，批内和批间重复试验的吸收变异系数分别在3．34％～8．12％和6．2％～9．04％之间。与HI的符合率达到92．8％，经卡方检验（P〈0．01）比HI试验敏感。为猪流感抗体检测提供了快速、准确、简便的方法。